400-0532-025
首页 > 动态资讯 > 必威【betway】官方网站资讯 > 黄曲霉毒素检测方法介...
时间：2016-11-23来源：必威【betway】官方网站生物点击量：
在当今社会，食品安全受到人们的非常的关注和重视，尤其发生了三聚氰胺和地沟油等一系列的事件之后，人们更加的重视食品的安全问题。黄曲霉毒素这类真菌在世界不同地区都发现大量存在于食品中，它主要是由黄曲霉和寄生曲霉等真菌产生的一类有毒次生代谢物［1–2］。目前已知的黄曲霉毒素及其衍生物有 20 余种 , 即 B1，B2，B2a，G1，G2，G2a，M1，M2 等，黄曲霉毒素 B1 是其中毒性最大的一种，实验结果显示，其毒性是人们熟知的剧毒药氰化钾的 10 倍，是砒霜的 68 倍。黄曲霉毒素 B1 可诱发癌症和皮下肉瘤，并且可使动物的肝、肾、大脑和神经系统等产生病变。自 20 世纪 60年代以来，有关黄曲霉毒素的危害被大量报道，以致黄曲霉毒素已成为最受人们关注的一种真菌毒素［3］。因此，寻求准确、快速、简便、价廉的检测方法，对黄曲霉毒素进行高效的定性定量分析，是黄曲霉毒素研究的一个重要方面。以下对黄曲霉毒素的检测方法研究进展进行评述。
1、薄层色谱法
1.1薄层层析（TLC）法
TLC 法是测定黄曲霉毒素的经典方法，在薄层板展开后，在 365 nm 紫外灯下，黄曲霉毒素 B1，B2，G1 和 G2 分别显示紫色、蓝紫色、绿色和绿色荧光。TLC 法的特异性较差，灵敏度相对较差，且测定黄曲霉毒素专一性不够，经常引起测量误差。但由于此法设备简单，易于普及，所以国内外仍在使用。
1.2高效薄层（HPTLC）法
HPTLC 法［4–5］测定黄曲霉毒素采用目前国际上流行的样品处理方法——固相萃取法（SPE）中针对真菌和病毒的多功能净化（MFC）柱。采用 MFC 柱净化后，仅用单相展开即可达到分离测定的目的，不仅节省了工作时间，提高了工作效率，而且进一步减少了有毒有害溶剂的用量。Stroka 等［6］将免疫亲合柱净化应用于 TLC 法测定，进行单相展开并用荧光密度计定量，此方法能检测含量明显低于当前欧盟标准的黄曲霉毒素。Kamimura 等［7］用HPTLC 方法测定玉米、花生、荞麦等样品，并与通过公职分析化学家协会（AOAC）认证的分析花生及花生制品中黄曲霉素的官方方法 CB（Contamination Branch）法和 BF（Best Foods）法进行比较，4 种主要黄曲霉毒素的检测限均不高于 0.2 μg／kg，回收率与 CB 法一样均高于 BF 法。
1.3高压薄层色谱（OPTLC）法
高压薄层色谱于 1979 年由 Tyihak 提出［8］，它结合了经典薄层色谱法、高效薄层色谱法与高效液相色谱法的优点，是一种能够提高薄层分离效率的平面液相色谱技术。随着实验技术的不断成熟，OPTLC 法在饲料和食物中黄曲霉毒素的检测方面的应用越来越多。Eszter Papp 等［9］发展了一系列适合检测玉米和小麦中黄曲霉毒素的 OPTLC 方法。
2、高效液相色谱（HPLC）法
由于具有稳定、准确、灵敏等优点，HPLC 法已成为当前进行黄曲霉毒素定量研究的首选方法。分析黄曲霉毒素的液相色谱方法包括正相液相色谱方法（NPLC）和反相液相色谱方法（RPLC）。反相高效液相色谱 (RP－HPLC) 系统易操作，流动相具有低毒性，可同时分离、分析样品中黄曲霉毒素B1，B2，G1，G2且不受样品沸点、热稳定性、和分子量限制，所以目前使用荧光检测器的反相HPLC 法已经成为检测黄曲霉毒素的主要测定方法［10］。
Chiavaro 等［11］根据不同环式糊精增强黄曲霉毒素 B1、B2、G1、G2、M1 荧光释放的不同效果，发展了将环式糊精加入到流动相中的高效液相色谱法，黄曲霉毒素 B1，B2，G1，G2 的检测限均在 0.3 μg／kg 以下，M1 的检测限在 0.000 5
μg／kg 以下，几种黄曲霉毒素都呈线性反应关系。这种方法也被用于测定自然污染及人工添加样品。
3、免疫学方法
黄曲霉毒素的免疫学检测方法是将生物大分子的免疫学特性与化学特性结合起来的检测方法。该方法具有快速、灵敏、对样品纯度要求不高的特点，特别适合于大批量样本的检测。用于检测黄曲霉毒素的免疫学方法有酶联免疫吸附测定法、放射免疫测定法、亲和层析法、荧光偏振免疫测定法及免疫层析法。
3.1酶联免疫吸附测定 (ELISA) 法
ELISA 法是在免疫学和细胞工程学基础上发展出来的一种微量检测技术，分为直接法、间接法、双抗体夹心法和竞争法，其优点是对黄曲霉毒素 B1 的检测定性定量准确而且检测速度快（比薄层法提高了近 200 倍）［12］，特异性强，荧光物质、色素、结构类似物对结果无干扰，回收率高，提取方法简单，成本较低，特别适合于对黄曲霉毒素 Bl 污染监测控制中大量样品的筛查［13–14］。缺点是 ELISA 法中酶的活性易受反应条件影响，测定结果重复性较差，测定结果易出现假阳性问题；此外 ELISA 试剂寿命短，需要低温保存，葡萄酒类、含盐量高的酱油、含脂量高的花生油在提取时要进行调节pH 值、脱盐、脱脂等特殊处理。
3.2亲和层析法
亲和层析法利用免疫化学反应原理，采用大剂量的单克隆抗体，选择性吸附提取液中的抗原物质黄曲霉毒素。由于抗原 – 抗体反应具有高灵敏、高选择、高特异性等特点，从而大大提高了试样的净化效果及检测灵敏度，同时可显著减少有毒有害试剂的使用，有利于操作人员的身体健康和环境保护。
3.3放射免疫 (RIA) 法
RIA 法与 ELISA 法基本相似，不同的是它们所使用的标记物不同，ELISA 法的标记物为酶，RIA 法所用的标记物一般为放射性元素氚 (3H)。该方法是将毒素 –3H 标记物与样品加抗体进行竞争性结合，除去未结合的部分，测定其放射性，放射性强则说明样品中毒素含量低，反之毒素含量高［15］。实验证明 ELISA 比 RIA 灵敏度更高且更简便，并且RIA 需要特殊设备，有放射性元素污染问题，人员需要安全防护，现在已经很少使用。
3.4荧光偏振免疫测定法
荧光偏振免疫测定法的主要原理是荧光标记的毒素在样品缓冲液中与未荧光标记的毒素对特异性抗体的竞争性结合。分子质量越大，分子旋转速度越慢，荧光偏振值越大。Nasir 等［16］报道了用基于荧光偏振的装置检测不同谷物中的黄曲霉毒素。
3.5免疫层析（IC）法
IC 法是 20 世纪 80 年代初发展起来的一种快速免疫分析技术，其操作简单，快速，人员不用培训，且不需特殊的仪器设备，非常适用于现场测试和进行大量样品的初筛［17］。
4、免疫学与仪器结合方法
近年来，随着黄曲霉毒素在食品中的检出标准越来越严格，很多人采取了免疫学与仪器结合的方法来检测黄曲霉毒素，发展了黄曲霉毒素的检测方法。
4.1免疫亲和柱净化荧光光度法
张艺兵等［18］提出了一种以免疫亲和柱净化结合荧光光度法检测黄曲霉毒素的新方法，此法利用抗原抗体——对应的特异吸附特性，以黄曲霉毒素单克隆抗体为填充柱，特异性、选择性地吸附黄曲霉毒素，再以甲醇为流动相将结合的黄曲霉毒素洗脱下来然后通过溴溶液衍生，所得衍生物可发射荧光，再通过荧光光度计分析即可以测定毒素含量。此方法克服了 TLC 法和 HPLC 法在操作过程中使用剧毒的真菌毒素作为标定标准物和在样品预处理过程中使用多种有毒、有异味的有机溶剂对操作人员造成身体伤害和污染环境的缺点，所需仪器设备轻便易携带，自动化程度高，操作简单，灵敏度可达 1 μg／kg，回收率在 85％以上。一个样品只需10～15 min 便能直接读出测试结果，比传统方法快几个小时甚至几天时间。缺点是此法只能测定黄曲霉毒素的总量且对试剂要求比较高，检测中药材黄曲霉毒素的含量时结果会出现一些假阳性。
4.2免疫亲和柱高效液相色谱法
免疫亲和柱（IAC）是将特异性的黄曲霉毒素单克隆抗体与载体蛋白偶联并填柱而成。由于抗原抗体有一一对应的特异性吸附关系，所以 IAC 能特效性地、高选择性地吸附黄曲霉毒素，而让其它杂质通过柱子，使样品得以纯化，吸附的黄曲霉毒素可以被极性有机溶剂洗脱，再用 HPLC 法进行定量检测［19］，其优点是具有高度特异性，可除去绝大多数干扰物质，检测限达 1 ng／g，还具有快速、溶剂使用少、可以自动化和再生利用的特点。缺点是柱成本高，商品化 IAC 仅适合几种毒素，有时需要加预柱净化。
4.3多功能净化柱高效液相色谱法
Wilson 和 Romer［20］开发了独特的真菌毒素多功能净化 (MFC) 柱，MFC 柱提供一种快速的一步萃取纯化方法，工作原理和操作过程与其它净化柱相反，它含有亲脂性 ( 非极性 ) 和电荷活性成分 ( 极性 )，当样品提取液通过柱时，MFC柱保留样品液中的干扰物质如脂肪、蛋白质类化合物和碳水化合物等，而待测组分黄曲霉毒素不被吸附而直接通过，从而一步完成净化过程，除去 90％的杂质，减少了传统净化方式淋洗杂质和洗脱待测样品的步骤，从而达到净化目的，这一点是 IAC 和普通 SPE 净化柱所不具备的，并且与 IAC 相比净化效果同样理想，回收率高，灵敏度高，检测限低。
5、超光谱（HS）法
一直以来，黄曲霉毒素的检测都用化学方法，并且有些化学方法的检测结果非常准确，但是化学方法都要耗费大量的检测时间，检测费用较高且损坏检测样品，所以研究一种快速、准确、无损样品的检测方法对粮食产业是至关重要的，超光谱法检测黄曲霉毒就是这样一种方法。它的原理是首先通过光源激发待测样品，再通过设备捕捉成像，然后对成像进行特征抽取和特征排列，最后实现区别受黄曲霉毒素污染和未受黄曲霉毒素污染的样品。
Haibo Yao［21］等利用超光谱法分析了长波紫外线激发下的玉米粒的光谱 BGYF 响应，首先用中心激发波长为 365 nm 的紫外线光照射检测样品，被检测到黄绿色荧光的玉米粒，手动挑选出来，结果显示，在 500～515 nm 波长范围具有较强的黄绿色荧光发射光谱峰，选取 500～515 nm 有较强黄绿色荧光的玉米粒作为阳性组，用高效液相色谱法测定，与正常组对比，呈黄绿色荧光成像的黄曲霉毒素浓度的平均水平浓度是 5.114 μg／g。这个实验证明了玉米只有在感染黄曲霉毒素多的时候才会发出黄绿色荧光，所以根据 BGYF 测量黄曲霉毒素的含量是不准确的。
Haibo Yao 等［22］还发现感染黄曲霉毒素的玉米会发生峰偏移现象，受黄曲霉毒素感染高的玉米粒其光谱峰会向长波方向移动，未受感染或者感染率低的玉米粒光谱峰会向短波方向移动，并且受黄曲霉毒素感染高的玉米粒比未受感染的玉米粒光谱峰强度低。使用超光谱法和光谱角度映射分类法对样品测试，样品荧光强度不敏感但对峰的变化敏感［23］，对待测玉米以 20，100 ng／g 为临界值做检测，分类精度为 86％时有 15％的假阳性率，88％时有 16％的假阳性率，结果表明，超光谱法和光谱角度映射分类法可以对感染与非感染玉米进行分类。
Haibo Yao 等［24］用中心波长为 365 nm 的紫外光激发待测玉米，用最大相似率和二进制编码两种算法分别对临界值为20，100 ng／g 进行实验，并与 HPLC 检测结果进行对比，发现二进制编码比最大相似率分类精确，20 ng／g 和 100 ng／g 的分类精度分别为 87%，88%。
Pearson 等［25］发现在 BGYF 光很弱的时候利用该检测系统无法检测到 BGYF。他用一个硅光电二极管光纤光谱仪通过辨别分析，利用光的反射比从含量小于 10 ng／g 或者没有被污染的玉米中检测出受黄曲霉毒素污染大于 100 ng／g 的玉米，分类精度达到 96.6%。
Kalkan 等［26］在 365 nm 的紫外灯下分析了 285 个榛子样品，在 440～450 nm 该鉴别能力最强的谱带分类精度达到 90%。Musa Ata 等［27］用超光谱法对红辣椒进行实验，选择卤素灯和紫外光两种光源进行对比，在对成像进行特征抽取时分为单独频带能量特征和连续绝对差异光谱波段能量两种，在成像的特征排列中用了最低冗余和最大相关性（mRMR）及多层感知器连接权重（MLP），并对单独频带能量特征和连续差异光谱波段能量使用了量子直方图矩阵方法，并与 HPLC 检测结果做了对比，最终实验结果表明光源采用卤素灯、特征排列方法采用MLP 法的分类精度最高（达 91%）。Haibo Yao 等［28］研究了窄频带光谱指数加速检测黄曲霉毒素的方法，原先因为受到发射响应的限制，成像的强度位准比较低，全部的检测结果持续时间很长，而窄频带光谱可以使这种情况得到改善。首先用归一化差异荧光指数（NDFI）、差异化指数（DFI）、荧光率指数（FRI）3 个指数与多谱线成像系统进行比较，发现两个系统的 NDFI 指数有最好的相关性，然后用窄频带光谱对25 g 和 1 kg 的样品分别做了临界值为 20，100 ng／g 的实验，并与 HPLC 进行比较。25 g 样品 20，100 ng／g 的分类精度为 83.33%，85.26% ；1 kg 样品 20，100 ng／g 的分类精度为69.23%，95.73%。6针对黄曲霉毒素 B1 的快速检测方法因为黄曲霉毒素 B1 是黄曲霉毒素中毒性最强的，所以随着对黄曲霉毒素研究的深入，产生了很多对其快速检测的方法。
6.1免疫亲和微柱检测法
免疫亲和微柱检测法的原理是试样提取液经过滤、稀释后，通过黄曲霉毒素 B1 免疫亲和柱。黄曲霉毒素 B1 免疫亲和柱是由偶联有黄曲霉毒素 B1 抗体的免疫亲和微球填充而成的，而此抗体对黄曲霉毒素 B1 具有专一性，样液中黄曲霉毒素 B1 被抗体捕获，杂质随洗涤液流出微柱，再以甲醇将黄曲霉毒素 B1 洗脱，洗脱液采用荧光光度法根据黄曲霉毒素 B1 检测工作曲线测定黄曲霉毒素 B1 的含量。朱剑［29］等用免疫亲和微柱法对大米，油脂，玉米粉做了黄曲霉毒素的检测并与酶联免疫吸附法作了比较，发现两种检测方法的准确度和灵敏度都比较高，免疫亲和微柱法比ELISA 的重复性好，对植物油中黄曲霉毒素 B1 含量检测结果准确可靠。ELISA 一次可以检测多个样本，适于大批量样 黄洁：黄曲霉毒素检测方法研究进展 103品快速筛选，免疫亲和微柱法一次只能检测一个样本，适于单一样品现场快速检测，都比较适合基层实验室推广使用。
6.2一步式金标试纸法
金标免疫层析 (GICA) 是 20 世纪 80 年代初发展起来的一种快速免疫诊断技术。一步式黄曲霉毒素检测金标试纸法是利用单克隆抗体而设计的固相免疫分析法，快速检测试纸利用纳米金作为标记物，可在 5～10 min 完成对样品中黄曲霉毒素的定性测定。它不需进行结合标记物与自由标记物的分离，省去了繁琐的加样、洗涤步骤，不仅提高了检测速度，而且检测过程中无需处理试剂，真正实现了一步式检测［30］。
Zhang 等［31］利用一步式金标试纸法分析一个样品，用时不到 10 min。在金标免疫试纸法的应用过程中，孙秀兰等［32］研究了样品基质对试纸条信号灵敏度的影响，为消除这些影响提供了经验。
邓省亮等［33］用柠檬酸三钠还原法制备胶体金颗粒，标记为抗黄曲霉毒素 B1。单克隆抗体并喷于玻璃纤维上，黄曲霉毒素 B1 偶联抗原和二抗分别结合于硝酸纤维膜上，依次将样本垫、胶金垫、硝酸纤维膜和吸水纸组装切割成胶体金试纸条并装入检测卡中。测试结果表明，黄曲霉毒素 B1 快速检测试纸条的灵敏度为 5 ng／mL，检测时间为 10 min，批内和批间重复性 100%，假阳性率和假阴性率均为 0。
6.3时间分辨荧光免疫分析法 (TRFIA)
TRFIA 是超微量检测中一项新兴检测技术，灵敏度较放射免疫分析 (RIA) 高出 3 个数量级。TRFIA 原理与 ELISA一致，不同的是 TRFIA 采用了一种特殊的标记物，即 3 价稀土离子 (Eu3+，Tb3+等 ) 代替酶标记物或其它荧光物，用时间分辨荧光仪测定产物中的荧光强度，从而判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析的目的。TRFIA 利用稀土元素荧光波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外－可见分光分析法中杂色光的影响，可大幅度提高分析的灵敏度。黄飚等［34］采用自制黄曲霉毒素 B1 全抗原和多克隆抗体，构建了一套较为完整的黄曲霉毒素 B1－TRFIA 检测平台，具有较好的分析稳定性，灵敏度达到 0.003 9 μg／L，线性范围 0.003 9～100 μg／L。灵敏度和测量范围均超越了市场上常用的进口或国产酶联免疫检测试剂 ( 分别为 0.1 μg／L 和0.1～10 μg／L)，经过多方面考核，各项指标符合标记免疫试剂的要求，对食品、饲料等样本检测效果均佳，具有很好的应用前景。
7、结语
综上所述，黄曲霉毒素具有高的致癌、致畸性，因而受到全世界的广泛关注。在人们对食品安全的意识不断提高的今天，加强对黄曲霉毒素的监控和检测非常必要。纵观其发展趋势，主要有两个发展方向，即对现有方法的改进和新方法的开发。常用的检测黄曲霉毒素的方法，即薄层色谱法、酶联免疫法及高效液相色谱法，因检测速度慢、精确度低、检测费用高等原因而影响了对黄曲霉毒素监控的广泛性及检测的即时性，需要加以改进。传统检测方法的不足促使黄曲霉毒素快速、准确检测方法的研发，例如超光谱法，它是一种无侵入性，无损性，快速、准确检测黄曲霉毒素的新方法，已经使用它对花生，玉米，辣椒，坚果类等进行了黄曲霉毒素的检测，并且准确度较高，是以后发展的方向；还有像电子鼻法、生物传感器等方法还不完善，需要改进，未来这些方法的发展会使快速、准确、安全的检测黄曲霉毒素成为可能。
上海必威【betway】官方网站生物基于全球领先的时间分辨荧光定量POCT检测技术平台，推出了黄曲霉毒素B1快速定量检测仪和黄曲霉毒素B1荧光定量快速检测卡，以可在10min内快速准确定量的测定各种粮食谷物、油料作物、植物油、饲料原料及部分饲料中黄曲霉毒素B1的含量，样品前处理简单，操作简便，采用荧光读数仪读数，结果准确可靠，适用于各类粮食、粮油、饲料加工企业、第三方检测机构及各级政府监管部门。
操作视频地址：
1、 灵敏度：0.5ng/mL；
2、 定量线性范围：1.0ng/mL - 50.0 ng/mL；
3、样品前处理时间：8min；
4、检测时间：10min；
5、准确度：添加回收率为80%-125%；
6、 特异性：在1000 ng/mL浓度水平下与其它真菌毒素无交叉反应；
二、黄曲霉毒素B1荧光定量检测卡检测流程示意图
三、黄曲霉毒素B1快速检测仪结果判读和输出
黄曲霉素B1荧光定量检测卡采用便携式荧光免疫分析仪进行读数，使得检测结果更加准确、客观，避免人为的误判。
返回新闻列表
欢迎关注必威【betway】官方网站生物微信
微信号：Femdetection
微信名称：必威【betway】官方网站微讯
